Ausrüstungs-Treffentest Streptomycin (SM) ELISA
1. Prinzip
Diese Testausrüstung basiert auf dem wettbewerbsfähigen Enzym Immunoassay für die Entdeckung des Sulfonamidrückstandes. Die Koppelungsantigene werden auf den mikro--gut Streifen vorgalvanisiert. Die Sulfonamide in der Probe und in den Koppelungsantigenen, die auf den mikro--gut Streifen vorgalvanisiert werden, konkurrieren für die Antisulfonamidantikörper. Nachdem der Zusatz des Enzymparonyms, das TMB-Substrat für Färbung hinzugefügt ist. Der optische Dichte (OD)-Wert der Probe hat eine negative Wechselbeziehung mit den Sulfonamiden in der Probe. Dieser Wert wird mit der Standardkurve verglichen und die Sulfonamidkonzentration wird nachher erreicht.
2. technische Spezifikationen
Empfindlichkeit: 1 ppb
Brutkastentemperatur: 25℃
Brutkastenzeit: 30min~15min
Nachweisgrenze
Gewebe (Hoch-Entdeckunggrenzmethode) 0,4 ppb
Gewebe (Niedrig-Entdeckunggrenzmethode) ppb 5
Ppb Honey1
Empfindlichkeit: 0,1 ppb
Inkubationstemperatur: 37℃
Inkubationszeit: 30min-30min-15min
Nachweisgrenze:
Huhn1 ppb
Hühnerleber, melken ppb 4
Honig, Gelée royale 2 ppb
Wiederfindungsrate:
Milch 85±22%
Huhn 80±17%
Honig, Gelée royale 75±19%
Kreuzreaktionsrate:
Streptomycin 100%
Dihydrostreptomycin 108%
Schlussfolgerung <0>
Kalamycin <0>
Gentamycin gezeichnet von der Kreuzreaktionsrate: Diese Ausrüstung kann für den Test von Sulfonamiden benutzt werden, befriedigen total die nationale Prüfungsnachfrage von Sulfonamiden.
Wiederfindungsrate
Gewebe, Urin, milk85±25%
Honig, serum80±23%
3. Komponenten
1) mikro--gut Streifen: 12 Streifen mit 8 entfernbaren Brunnen jeder
2) Standardlösung 6× (je 1 ml): 0 ppb, 0,1 ppb, 0,4 ppb, 1,6 ppb, 6,4 ppb, ppb 25,6
3) verbundene (12 ml) rote Kappe des Enzyms
4) blaue Kappe der Antikörperfunktionslösung (7 ml)
5) weiße Kappe der Lösung des Substrates A (7 ml)
6) Schwarzkappe der Lösung des Substrates B (7 ml)
7) stoppen Gelbkappe der Lösung (7 ml)
8) konzentrierte 20× waschende weiße Kappe des Puffers (40 ml)
9) konzentrierte 10× das Wieder auflösen der transparenten Kappe der Lösung (50 ml)
4. Materialien erfordert aber nicht bereitgestellt
1) Ausrüstung: microplate Leser, Drucker, Homogenisierer, Stickstofftrocknergerät, die Zentrifuge, messend pipettiert, Balance (eine Empfindlichkeit gegenseitig von 0,01 g), Brutkasten
2) Mikropipetten: Einkanal- µL 20-200 µL, 100-1000 und Mehrkanal-µL 30-300;
3) Reagenzien: Acetonitril (CH3CN), Ethylacetat, N-Hexan, K2HPO4·12H2O, Zitronensäurenmonohydrat (C6H8O7·H2O), HCl, NaOH, CH2Cl2,
5. Beispielvorbehandlung
Anweisungen (mit die folgenden Punkte müssen vor der Vorbehandlung beschäftigt werden)
1) nur die Wegwerfspitzen können für die Experimente verwendet werden und die Spitzen müssen geändert werden, wenn sie für das Absorbieren von verschiedenen Reagenzien verwendet werden;
2) vor dem Experiment, muss jedes experimentelle Gerät sauber sein und sollte gegebenenfalls wieder-gesäubert werden, um die Verschmutzung zu vermeiden, die die Versuchsergebnisse behindert.
Lösungsvorbereitung vor Beispielvorbehandlung:
1) 0.2M NaOH-Lösung: Wiegen Sie NaOH 0.8g, lösen Sie sich mit 100ml entionisiertem Wasser auf;
2) 0.5M HCl: Nehmen Sie HCl 4.3ml, lösen Sie sich mit entionisiertem Wasser zu 100ml, Mischung gleichmäßig auf;
3) Na2HPO4- C6H8O7·H2O-Puffer: wiegen Sie 19.85gNa2HPO4·12H2O und 9.3g C6H8O7·H2O, lösen sich mit entionisiertem Wasser zu 1L, Mischung gleichmäßig auf;
4) Lösung CH3CN-CH2Cl2: V CH3CN: V =1:4 CH2Cl2;
5) wird das 20×, das konzentriert wird, Lösung wieder auflösend, verdünnt mit entionisiertem Wasser am 1:19 (1-teilige starke wieder auflösende Lösung + 19 Teile entionisierte Wasser).
5,1 Gewebe
A.-Hoch-Entdeckung-Grenzmethode
Methode eine
1) wiegen 2,0 ± 0,05 g der homogenisierten Gewebeprobe in 50 ml-Zentrifugenrohr, addieren 6 ml des Ethylacetats, Erschütterung für 2 Minute, Zentrifuge an über 4000 r/min bei ℃ 15 für Minute 10;
2) nehmen 3 ml die klare organische Phase in einen trockenen Behälter, brennen durch, um mit Stickstoff oder Luft durch Drehverdampfung bei ℃ 50-60 vollständig zu trocknen
6) lösen die trockenen Rückstände in 1 ml der verdünnten wieder auflösenden Lösung, addieren 1 ml N-Hexan, Mischung für 30 Sekunden auf; Zentrifuge an über 4000 r/min an 15℃ für 5 Min. entfernen die Oberschicht N-Hexan Phase,
7) Lösung der Nehmenuntenschicht 50µl für weitere Analyse.
Falte der Verdünnung der Probe: 1
Methode zwei
1) wiegen 2 ± 0,05 g der homogenisierten Probe, sich setzte in Rohr der Trommel der Zentrifuge 50ml;
2) addieren Lösung 8ml CH3CN-CH2Cl2, Erschütterung für 5min, Zentrifuge an über 4000 r/min bei ℃ 15 für Minute 10;
3) übertragen organische Phase von 4 ml in einen trockenen Behälter, brennen durch, um mit Stickstoff oder Luft durch Drehverdampfung bei ℃ 56 vollständig zu trocknen
4) fügen 1 ml der verdünnten wieder auflösenden Lösung hinzu, um den trockenen Rückstand wieder aufzulösen, addieren 1 ml N-Hexan und rütteln für 30s. Zentrifuge an über 4000 r/min an 15℃ für Minute 5;
5) entfernen die Oberschicht N-Hexan Phase. Nehmen Sie 50, die µL unten Lösung für weitere Analyse überlagern.
Falte der Verdünnung der Probe: 1
Niedrig-Entdeckunggrenzmethode B. Tissue
1) wiegen 2,0 ± 0,05 g der homogenisierten Probe in ein 50-ml-zentrifugales Rohr, addieren 8 ml verdünnt, Lösung, Erschütterung wieder auflösend für 2 Minute, Zentrifuge an über 4000 r/min bei ℃ 15 für Minute 10;
2) nehmen 50 µL Lösung für weitere Analyse.
Falte der Verdünnung der Probe: 5
5,2 Serum
1) legen die Serumprobe in die Raumtemperatur für 30 Minute, Zentrifuge an über 4000r/min bei ℃ 10 für Minute 10, Trennung des Serums oder Filterserum
2) nehmen 1 ml-Serum und addieren 3mL die verdünnte wieder auflösende Lösung, Mischung für 30s.
3) nehmen 50 µL Lösung für weitere Analyse
Falte der Verdünnung der Probe: 4
5,3 Honig
1. wiegen Sie Honigprobe 2±0.05 g, hinzufügen 4 ml von 0,1 M H3PO4, Erschütterung, bis völlig aufgelöst.
2. zentrifugieren Sie an über 4000 r/min bei Zimmertemperatur (℃ 20-25) für Minute 5, bis Flüssigkeit klar ist (Honigprobe kann direkt zu Schritt 3 ohne Zentrifuge).
3. addieren Sie µL 900 1 m-NaOH, justieren pH bis 7-9 (für Gelée royale, übertragen Sie den Supernatant auf ein neues Schiff).
4. zentrifugieren Sie an über 4000 r/min bei Zimmertemperatur (℃ 20-25) für Minute 5, bis Flüssigkeit klar ist.
5. nehmen Sie 50 µL Supernatant, fügen Sie µL 350 der verdünnten wieder auflösenden Lösung, hinzu und mischen Sie gleichmäßig für 30s.
6. nehmen Sie 50 µL für weitere Analyse.
Falte der Verdünnung der Probe: 20
5,4 Urin
1. fügen Sie 3 ml die verdünnte wieder auflösende Lösung und 1 ml der zentrifugierten klaren Urinprobe, Mischung richtig für 30s hinzu.
2. nehmen Sie 50 µL für weitere Analyse
Falte der Verdünnung der Probe: 4
5,5 Milch
1. nehmen Sie 1 ml Milch, addieren die verdünnte wieder auflösende Lösung, die am 1:19 (Ⅴ/Ⅴ) verdünnt ist (20 µL Milch + µL 380 die verdünnte wieder auflösende Lösung) und an der Mischung für 30s.
2. nehmen Sie 50 µL für weitere Analyse
Falte der Verdünnung der Probe: 20
6. ELISA-Verfahren
6,1 Anweisungen
1. holen Sie alle Reagenzien und mikro--gut Streifen zur Raumtemperatur (℃ 20-25) vor Gebrauch;
2. bringen Sie alle Reagenzien zu ℃ 2-8 sofort nach Gebrauch zurück;
3. Die Reproduzierbarkeit der ELISA-Analyse hängt in hohem Grade von der Übereinstimmung der Plattenreinigung ab. Die korrekte Operation der Plattenreinigung ist der springende Punkt in den Verfahren von ELISA;
4. Für die Ausbrütung bei den konstanten Temperaturen, müssen alle Proben und Reagenzien Belichtung vermeiden, und jedes microplate sollte durch die Abdeckungsmembran versiegelt werden.
6,2 Operationsverfahren
1. nehmen Sie alle notwendigen Reagenzien heraus und setzen Sie an der Raumtemperatur (℃ 20-25) für mindestens 30min. Merken Sie, dass jedes Reagens gerüttelt werden muss, um gleichmäßig vor Gebrauch zu mischen;
2. nehmen Sie die erforderlichen mikro--gut Streifen und die Plattenrahmen. Versiegelte das unbenutzte microplate wieder, gespeichert bei ℃ 2 - 8;
3. waschende Puffervorbereitung: verdünnen Sie 40 ml des 20× starken waschenden Puffers mit entionisierten Wasser am 1:19 (1-teiliger 20× starker waschender Puffer + 19 Teile entionisierte Wasser). Oder bereiten Sie waschenden Puffer als benötigte Quantität vor.
4. Nummerierung: nummerieren Sie die Mikrobrunnen entsprechend Proben und Standardlösung; jede Probe und Standardlösung sollten in doppelter Ausführung durchgeführt werden; notieren Sie ihre Positionen;
5. fügen Sie µL 50 der Probe hinzu, oder die Standardlösung, zum von doppelten Brunnen zu trennen, fügen µL 50 des Enzymparonyms hinzu, dann fügen µL 50 der Antikörperfunktionslösung in jedes gut hinzu. Mischen Sie, indem Sie leicht rütteln, versiegeln Sie das microplate mit der Abdeckungsmembran, und brüten Sie an 25℃ für Minute 30 aus;
6. waschen Sie das microplate mit dem waschenden Puffer bei 250 µL/well für vier bis fünfmal.; tränken Sie gut mit dem waschenden Puffer für sek 15-30, Klappe, um mit saugfähigem Papier zu trocknen (wenn es die Blasen, nachdem man gibt geflattert hat, sie mit den sauberen Spitzen schneidet);
7. Färbung: fügen Sie µL 50 µL der Lösung des Substrates A und 50 der b-Lösung in jedes gut hinzu. Mischen Sie, indem Sie leicht rütteln, und brüten Sie bei ℃ 25 für Minute 15 in der Dunkelheit für Färbung aus;
8. Bestimmung: addieren Sie 50, die µL von Lösung in jedes gut stoppen. Mischen Sie, indem Sie leicht rütteln. Stellen Sie die Wellenlänge des microplate Lesers bei 450 Nanometer ein, um den Od-Wert zu bestimmen. (Empfehlen Sie sich, den Od-Wert an der Doppel-wellenlänge zu lesen 450/630 Nanometer innerhalb Minute 5).
7. Ergebnisurteil
Es gibt zwei Methoden, zum der Ergebnisse zu beurteilen; das erste man ist das raue Urteil, während das zweite die quantitative Bestimmung ist. Merken Sie, dass der Od-Wert der Probe eine negative Wechselbeziehung mit dem Inhalt von Sulfonamiden in der Probe hat.
7,1 qualitative Bestimmung
Der Konzentrationsbereich (ng/mL) erhielt vom Vergleich den durchschnittlichen Od-Wert der Probe mit dem der Standardlösung. , dass der Od-Wert des Beispiel- Ⅰ 0,3, ist- und das des Beispiel-Ⅱ ist- 1,0, den Od-Wert von Standardlösungen anzunehmen ist: 2,243 für 0ppb, 1,816 für 1ppb, 1,415 für 3ppb, 0,74 für 9ppb, 0,313 für 27ppb, 0,155 für 81ppb, dementsprechend der Konzentrationsbereich des Beispiel- Ⅰ ist- 27ppb zu 81ppb, und das des Beispiel-Ⅱ ist- 3ppb zu 9ppb. (Multipliziert mit der entsprechenden Verdünnungsfalte)
7,2 quantitative Bestimmung
Die Mittelwert der Absorptionswerte ist mit dem Prozentsatz des durchschnittlichen Od-Wertes (b) der Probe und der Standardlösung gleichwertig, die durch den Od-Wert (B0) geteilt werden der ersten Standardlösung (0 Standard) und nachher bis zum 100% d.h., die multipliziert sind
Prozentsatz von Absorptionswert = von B ×100% /B0
B-the berechnen (doppelte Brunnen) Od-Wertes der Probe oder der Standardlösung
B0-the berechnen Od-Wertes der Standardlösung 0ng/mL
Zeichnen Sie die Standardkurve mit den Absorptionsprozentsätzen der Standardlösungen und den halb Logarithmuswerten der Sulfonamidstandardlösungen (ng/mL) als y und X-Achse, beziehungsweise. Lesen Sie die entsprechende Konzentration der Probe von der Standardkurve, indem Sie seinen Absorptionsprozentsatz in die Standardkurve enthalten. Der resultierende Wert wird nachher mit der entsprechenden Verdünnungsfalte multipliziert und schließlich erreicht die Sulfonamidkonzentration in der Probe.
Unter Verwendung analysierend ist die Berufssoftware dieser Ausrüstung für die genaue und schnelle Analyse einer großen Menge Proben bequemer. (Treten Sie mit uns bitte für diese Software in Verbindung).
8. Vorkehrungen
1. Die Raumtemperatur unterhalb ℃ 25 oder die Temperatur der Reagenzien und der Proben, die nicht zur Raumtemperatur (℃ 20-25) zurückgegangen werden führen zu einen niedrigeren Standard Od-Wert.
2. wird Trockenheit des microplate im Waschvorgang von den Situationen einschließlich die nichtlinearen Standardkurven und die unerwünschte Reproduzierbarkeit begleitet; Fahren Sie so zum nächsten Schritt sofort nach dem Waschen fort.
3. mischen Sie gleichmäßig, andernfalls gibt es die unerwünschte Reproduzierbarkeit.
4. Die Endlösung ist- die 2-m-Schwefelsäurelösung, vermeiden, mit der Haut in Verbindung zu treten.
5. Benutzen Sie nicht die Ausrüstung, die sein Verfallsdatum übersteigt. Der Gebrauch der verdünnten oder verfälschten Reagenzien von den Ausrüstungen führt zu die Änderungen in der Empfindlichkeit und in den Entdeckungsod-Werten. Tauschen Sie nicht die Reagenzien von den Ausrüstungen von verschiedenen Partienummern aus, um zu verwenden.
6. setzen Sie das unbenutzte microplate in eine Selbst-dichtungstasche, um sie wieder zu versiegeln. Die Standardsubstanz und die farblose Farbe, die ehemalig ist, ist lichtempfindlich, und folglich können sie nicht dem Licht direkt ausgesetzt werden.
7. werfen Sie die Färbungslösung mit jeder möglicher Farbe weg, die die Degeneration dieser Lösung anzeigt. Der Entdeckungswert der 0 Standardlösung von weniger als 0,5 (A450 Nanometer< 0="">
8. Die optimale Reaktionstemperatur ist ℃ 25, und zu hoch oder zu niedrige Temperaturen ergeben die Änderungen in der Entdeckungsempfindlichkeit und IN Od-Werten.
9. Lagerung und Verfallsdatum
Lagerung: Speicher bei dem ℃ 2-8, nicht eingefroren.
Verfallsdatum: 1-jährig; Herstellungsdatum ist auf Kasten.
